刺参腐皮综合征发生的分子调控机制研究进展

2003年以来, 海参产业发展速度和拓展规模均达到前所未有的水平, 在国内形成了继海带、对虾、扇贝、海水鱼类养殖之后"第五次"海水养殖产业浪潮.伴随着养殖规模和密度的扩大, 病害问题也日益凸显, 已逐渐成为海参产业健康发展的瓶颈, 对生态环境和食品安全威胁巨大, 其中以腐皮综合征最具代表性.本文梳理分析了刺参Apostichopus japonicus腐皮综合征的主要病原, 系统阐述了刺参应对病原感染的免疫调节机制和代表性病原致病机制研究进展, 总结了刺参病害的生态防治方法, 并在实现刺参产业健康可持续发展、病原致病机制及环境调控疾病发生研究等方面提出了相应发展对策, 以期为构建绿色健康的刺参疾病防控策略提供参考.     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA, 是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验。在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下, 取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤, 并达到研究相关基因表达的目的。本研究利用TR izo l法提取RNA, 获得的各样品RNA条带完整、纯度高。结果表明, 4 种保护性组织提取的RNA 经过逆转录反应, 得到了高质量的CDNA。内标基因( B- actin)、热激蛋白基因( hsp70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带, 通过NCB I数据上的BLAST比对证明, 各序列的同源性在95%以上。利用本研究的方法, 可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性, 用于进一步的分子生物学研究。     

三疣梭子蟹Sox基因HMG盒的克隆分析

利用能扩增人类SRY基因HMG盒的一对简并引物,分别对三疣梭子蟹雌雄个体基因组DNA进行扩增,均得到216 bp和约400 bp的两条带,不存在性别差异,通过PCR-SSCP分析,未发现雌蟹或雄蟹所特有的Sox基因。对216 bp的带进行克隆测序得到6个Sox基因,分别命名为PTSox21、PTSox12、PTSox11a、PTSox11b、PTSox11c和PTSox4。其中,PTSox21、PTSox12和PTSox4氨基酸序列与人类Sox21、Sox12和Sox4基因的同源性分别为90%、66%和63%,PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c氨基酸序列均与人类Sox11基因有63%的同源性。此外,PTSox11a和PTSox11b的氨基酸序列之间的同源性达到了98.6%,只在第44位氨基酸残基不同。与其他物种Sox基因氨基酸序列的同源性比较发现,PTSox21与饰纹姬蛙Sox2a有92%的同源性,而PTSox12、PTSox11a、PTSox11b和PTSox11c均与意大利蜜蜂的Sox1有73%的同源性,PTSox4与意大利蜜蜂的Sox1有72%的同源性。     

湖南镇水库浮游生物及其影响因子的典范对应分析

2006年至2007年间调查了蓝藻(Cyanophyta)暴发水体——湖南镇水库的浮游生物群落结构及其变化,研究了其与环境参数之间的关系。调查期间,共鉴定出浮游植物96种(属),浮游动物73种(属)。单位水体浮游植物平均细胞数量变化于0.49×106～16.71×106L-1之间,浮游动物则变化于8～3548L-1之间。春、夏季螺旋鱼腥藻(Anabaena sporoides)水华持续数月,水体表层细胞密度高达2.28×108L-1,进入秋季后其优势逐渐被颤藻属(Oscillatoria)蓝藻取代。典范对应分析显示,浮游植物的季节演替规律与螺旋鱼腥藻数量、总溶解固形物(TDS)和透明度(SD)存在较高的相关性,浮游动物演替主要与溶解在水中的微囊藻(Microcystis)毒素(EMC)、营养盐和螺旋鱼腥藻数量相关。由于高水平营养盐的存在,上行效应无法有效限制蓝藻的发生,水华蓝藻以其数量优势改变了水体理化条件,成为影响浮游植物群落的潜在因素,而营养盐可能通过主导可食藻类的生长,间接影响浮游动物的动态。将水华蓝藻数量及藻毒素浓度作为环境因子进行多元分析,分别提高了对浮游植物、动物群落的解释15.6%和25.8%,说明水华蓝藻和藻毒素的存在对浮游生物群落的组成和结构具有较大的影响。     

杂色鲍的血细胞

通过光镜、电镜技术，比较了正常状态和受到细菌刺激后杂色鲍血细胞的变化。结果显示，正常状态下的杂色鲍血细胞分为三种类型：颗粒细胞、透明细胞和小细胞；杂色鲍血细胞具有很强的免疫功能，对外界刺激敏感；受到细菌刺激后杂色鲍的血细胞在结构和形态上均发生显著的变化。并推测，颗粒细胞的颗粒中含有大量的水解酶类和抗菌肽等免疫因子，发挥主要的免疫作用。     

三疣梭子蟹血淋巴免疫功能的初步研究

利用API ZYM试剂盒和酶活力测试盒检测了三疣梭子蟹血细胞及血清中的19种酶类及血清中溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性。试验结果表明,在雄蟹血清和血细胞中均检测到19种酶,在雌蟹血清和血细胞中分别检测到18种和16种。碱性磷酸酶和酸性磷酸酶的活性很低。在此基础上,研究了三疣梭子蟹血清和血细胞溶解物(HLS)对溶藻弧菌的抗菌活力,结果显示血清样品对溶藻弧菌的抗菌活力较强,但其体外作用的持续时间较短;而血细胞溶菌酶对溶藻弧菌的抗菌活力较弱。     

魁蚶精子发生的超微结构

利用透射电镜(TEM)技术观察了魁蚶精子发生过程的超微结构变化。结果表明:魁蚶精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子形成等过程,在精子形成中的主要细胞学事件包括顶体的发育、核形态变化及尾部的形成等。此过程中,前顶体颗粒聚集、融合,形成顶体囊,然后发育为圆锥形顶体;核的形态由圆形或卵圆形变为鼓形,核内染色质由团块状到颗粒状,再到高电子密度均质;线粒体聚集、融合、体积变大,迁移至核的后端,参与精子中段的形成。成熟精子由头部、中段及尾部组成,头部由顶体及核构成,中段由5个线粒体围绕远端中心粒组成,尾部为细长的鞭毛。研究亮点:魁蚶为我国重要的海产经济贝类之一,目前对其精子发生过程的超微结构未见研究报道。利用透射电镜技术观察了魁蚶精子发生过程中精子顶体的形成、核的形态建成等主要细胞学事件,探明了魁蚶精子属原生型,顶体物质的合成始于初级精母细胞时期,细胞核在精子发生过程中形态变化不大等问题,为蚶科精子发生机制的深入研究提供了参考。     

应用彗星试验研究产毒微囊藻喂食暴露对铜锈环棱螺肝细胞DNA的损伤

把铜锈环棱螺（Bellamya aeruginosa）暴露于3组不同成分的微藻悬浮液中[蓝藻组：只投喂产毒铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）;混合藻组：50%四尾柵藻（Scenedesmus quadricanda）＋50%产毒铜绿微囊藻;对照组：只投喂四尾柵藻],用酶联免疫检测法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）检测藻液和螺肝组织中的藻毒素浓度。结果表明,藻液中包括藻相和水相的总微囊藻毒素（MCs）浓度分别为：蓝藻组（36.34±4.12）μg·L-1;混合藻组（18.69±2.12）μg·L-1;对照组未检出。在喂食暴露的前6h内,混合藻组和蓝藻组螺肝组织中微囊藻毒素含量持续增长,而后出现下降趋势;第12h更换藻液并将微藻浓度调整至初始值后,肝组织中MCs含量又迅速回升。同期螺肝细胞DNA损伤指标彗星尾长（TL）、彗星尾距（TM）和彗星尾部DNA百分含量（Tail DNA%）也随螺肝组织中MCs含量发生相应变化,各项DNA损伤指标均在产毒微囊藻喂食暴露6h时达到最大值,之后,各项指标值有所回落,但第12h更换藻液后,DNA损伤再次加剧。整个实验期间（24h）,混合藻组和蓝藻组的DNA损伤指标均显著高于对照组,混合藻组均显著高于蓝藻组。说明铜锈环棱螺经产毒微囊藻喂食暴露后,其肝组织细胞的DNA受到损伤,且螺肝组织MCs积累越多,DNA损伤越严重。     

谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼抗氧化能力和非特异性免疫力的影响

本试验旨在研究谷氨酰胺对黄颡鱼幼鱼抗氧化能力及非特异性免疫力的影响。选取平均体重为(2.49±0.04)g的黄颡鱼幼鱼240尾,随机分为4组,每组3个重复,每个重复20尾。4组试验鱼分别饲喂谷氨酰胺添加量为0(对照)、0.1%、0.2%、0.4%的等氮等能试验饲料。试验期为10周。结果表明:饲料中添加0.2%的谷氨酰胺可以显著提高黄颡鱼幼鱼的血清总蛋白、球蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量(P0.05);各组黄颡鱼幼鱼的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性差异不显著(P0.05);饲料中添加0.1%的谷氨酰胺可以显著提高黄颡鱼幼鱼肝脏中过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶及肌肉中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性(P0.05);随着饲料中谷氨酰胺添加量的增加,头肾巨噬细胞的吞噬指数呈升高趋势,且0.2%和0.4%组较对照组显著升高(P0.05),但0.2%和0.4%组间差异不显著(P0.05)。由此可见,饲料中添加0.1%~0.2%的谷氨酰胺能够提高机体的抗氧化能力和非特异性免疫力。     

三疣梭子蟹B型清道夫受体蛋白的原核表达及细胞、组织分布研究

B型清道夫受体是清道夫受体超家族成员,可识别多种配体,在机体脂类转运及免疫防御过程中发挥重要作用。为深入研究三疣梭子蟹B型清道夫受体(Pt-SRB)的功能,本实验在前期工作基础上构建了Pt-SRB胞外结构域原核表达载体,并成功获得了重组蛋白rPt-SRB。利用亲和层析方法获得纯化的rPt-SRB,并将纯化rPt-SRB蛋白免疫大鼠获得抗rPt-SRB重组蛋白免疫抗血清以用于后续研究。SDS-PAGE检测发现,体外诱导表达重组rPt-SRB以包涵体的形式出现在大肠杆菌BL21裂解液的沉淀中,分子量大小约为49.18 ku。Western-Blot分析表明,大鼠抗rPt-SRB血清能与rPt-SRB特异性结合。本实验还利用免疫荧光技术,对Pt-SRB在三疣梭子蟹血淋巴细胞的定位及不同组织中的分布进行研究。结果显示,Pt-SRB在三疣梭子蟹消化道、肝胰腺、鳃、心脏、肌肉组织中均有分布,但不同组织中Pt-SRB的分布不同。免疫荧光结果显示,绿色荧光信号在消化道及腺体结缔组织中较强,另外在肝小管上皮、鳃丝上皮细胞中亦有较强的阳性信号,表明PtSRB蛋白在上述组织结构中分布较广;在血淋巴细胞中,绿色荧光信号主要分布于细胞质和细胞膜,在细胞核中没有明显荧光信号,提示Pt-SRB在三疣梭子蟹血淋巴细胞的细胞质和细胞膜上表达。本结果将为三疣梭子蟹B型清道夫受体蛋白的生理及免疫学功能的研究奠定基础。